Σύντομα

Ο πολλαπλασιασμός των θραυσμάτων DNA


Με τον κατακερματισμό μορίων ϋΝΑ που χρησιμοποιούν ένζυμα περιορισμού και την αναγνώρισή τους με ηλεκτροφόρηση πηκτής, το επόμενο στάδιο είναι ο πολλαπλασιασμός (κλωνοποίηση) του λαμβανόμενου θραύσματος και η υποβολή τους σε τεχνολογία ανασυνδυασμένου ϋΝΑ.

Αναφέρεται η τεχνική του πολλαπλασιασμού του κλώνου DNA PCR (αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης).

Στη δεκαετία του 1980, η τεχνική PCR χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή χιλιάδων αντιγράφων ενός μόνο τεμαχίου DNA. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται σε δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν ϋΝΑ και κάποιες άλλες απαραίτητες ενώσεις, όπως π.χ. εναρκτήρες (Primer DNAs) και το Ένζυμο DNA πολυμεράσης (ένζυμο που κάνει αναδιπλασιασμό του DNA).

Το εναρκτήρες είναι κλάσματα ϋΝΑ, με περίπου 20 βάσεις (Α, Τ, C, G) συμπληρωματικές, δηλαδή δεσμεύονται με συμπληρωματικότητα με την αρχή της αλληλουχίας DNA που πολλαπλασιάζεται. Όταν πρόκειται να πολλαπλασιαστεί ένα μόριο ϋΝΑ, ο διπλός κλώνος πρέπει να διαχωριστεί, σχηματίζοντας έτσι δύο διαφορετικούς αλλά συμπληρωματικούς κλώνους. Κάθε ταινία θα χρησιμεύσει ως πρότυπο για την επικάλυψη, έτσι χρειαζόμαστε δύο διαφορετικούς τύπους εκκινητών (βλ. Εικόνα)

Τεχνική PCR, βήμα προς βήμα

Ένα ελάχιστο δείγμα DNA λαμβάνεται από ένα ανθρώπινο κύτταρο.

  1. Το δείγμα DNA, το ένζυμο αντιγραφής (ϋΝΑ πολυμεράση), τα νουκλεοτίδια ϋΝΑ και οι συμπληρωματικές αλληλουχίες αλληλουχίας ϋΝΑ τοποθετούνται σε δοκιμαστικό σωλήνα.
  2. Ο δοκιμαστικός σωλήνας τοποθετείται σε μια μηχανή PCR (μια μηχανή που αυξάνει και χαμηλώνει τη θερμοκρασία σύμφωνα με ένα πρόγραμμα). Τα παρακάτω βήματα θέρμανσης και ψύξης πραγματοποιούνται στο εσωτερικό του μηχανήματος που ελέγχεται από το πρόγραμμα.
  3. Ο σωλήνας θερμαίνεται στους 94 ° C για μετουσίωση (διαχωρισμός του διπλού κλώνου) του DNA.

4. Κάθε μεμονωμένος κλώνος μετουσιωμένου DNA χρησιμεύει ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων συμπληρωματικών κλώνων. Γι 'αυτό, ψύχεται στους 54 ° C όπου οι εκκινητές δακτυλίουν στην αρχή των δύο απλών ταινιών, χρησιμεύοντας ως εκκινητές για το ένζυμο πολυμεράσης.

5. Ο σωλήνας επαναθερμαίνεται στους 72 ° C (ιδανική θερμοκρασία λειτουργίας πολυμεράσης DNA) για την επανάληψη της λωρίδας. Η ϋΝΑ πολυμεράση αρχίζει, μετά το τέλος του εκκινητή, να τοποθετήσει τα ελεύθερα νουκλεοτίδια επί του κλώνου ϋΝΑ με σύνδεση αυτών, σχηματίζοντας έτσι ένα νέο διπλό κλώνο.